Устойчивость к инфекционным заболеваниям и высокая продуктивность являются взаимно-исключающими факторами.
Поэтому, можно услышать: забудем о селекции на генетичекую устойчивость к инфекционнным заболеваниям, так как их слишком много, а высокая иммунореактивность обходится слишком дорого.
Читайте об этом подробнее в статье ученых из Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий РАН, подготовленной специально для sfera.fm.
Отчасти это действительно так. В итоге мы можем говорить о косвенном отборе на повышенную восприимчивость к инфекционным заболеваниям, на фоне селекции на высокую продуктивность, оптимальную конферсию корма и иные хозяйственно-полезные признаки.
Тем не менее, следует различать индивидуальную устойчивость к отдельному инфекционному заболеванию и генетические факторы, влияющие на устойчивость к широкому кругу инфекций. Некоторые из таких факторов требуют большого расхода кормов за устойчивость к инфекциям, например фактор некроза опухолей и прочие провоспалительные медиаторы иммунного ответа.
Способность птицы различать все разнообразие вирусов, бактерий и паразитов кардинальнейшим образом зависит от гетерозиготности по локусам, кодирующим антиген-распознающие чати антител, транспортеров типа Tap1, MHC.
Обращаю Ваше внимание – эта способность не связана с повышенным расходом энергии корма и пластических веществ на функционирование иммунной системы птицы. Это – если можно так выразится, уровень грамотности иммунной системы. Например, и умный и глупый человек, в среднем потребляет одинаковое количество пищи. Так как ключевые гены связанные с MHC кур B-локус и Rfp-Y локус находятся на одном плече 16 хромосомы, то следует стремиться к максимальной гетерозиготности по гаплотипам вышеупомянутых локусов.
Именно у птицы хромосомы маленькие, и очень удачно расположены важнейшие гены определяющие специфический иммунитет. Поэтому, как минимум, наши финальные гибриды должны быть гетерозиготны по соответствующим локусам именно 16 хромосомы. Это серьезно снижает затраты на лабораторный контроль.
Удивительно – именно отечественное птицеводство, в отличие от скотоводства и свиноводства, полностью игнорирует как контроль генетической однородности комплектуемого поголовья, так и селекцию в направлении устойчивости к инфекциям (последнее утверждение, в ближайшее время станет спорным, надеюсь). В нашей стране есть все необходимое для решения озвученной проблемы и об этом я хотел бы поговорить подробнее.
О микросателлитной ДНК и ее использовании для выявления генетических различий кур в стадах.
Микросателлиты (от 1 до 10 нуклеотидов) и минисателлиты (> 10 нуклеотидов) представляют собой подкатегории тандемных повторов (TR), которые вместе с преобладающими вкрапленными повторами (или остатками мобильных элементов) составляют геномные повторяющиеся области.
TR являются эволюционно значимыми из-за их нестабильности. Они мутируют со скоростью от 10 3 до 10 6 на поколение клеток, т.е. до 10 порядков выше, чем точечные мутации ( Gemayel et al ., 2012 ). Микросателлиты - повторы простых последовательностей (SSR), короткие тандемные повторы (STR) обнаружены у бактерий, млекопитающих, птиц и т. д.
Они широко распространены по всему геному, особенно в эухроматине эукариот, а также в кодирующей и некодирующей ядерной и митохондриальной ДНК ( Pérez-Jiménez et al ., 2013 ; Phumichai et al ., 2015 ). Повторяющиеся полиморфизмы обычно возникают в результате добавления или удаления целых повторяющихся единиц или мотивов. Другими словами, полиморфизмы, наблюдаемые в SSR, являются результатом различий в числе повторов мотива, вызванных проскальзыванием цепи ДНК полимеразы при репликации ДНК или ошибками рекомбинации. Соответственно, разные линии кур отличаются по количеству повторов STR (рисунок 1).
Так как куры имеют двойной набор хромосом, то каждый локус STR может встречатся в геноме курицы или в одном варианте (т.е. такая курица гомозигота по одному и тому же аллелю) или в двух вариантах (такая курица имеет два аллельных варианта в данном участке генома и, соответственно - гетерозиготна).
Для изучения STR ПЦР – синтезируют огромное количество копий интересующего участка ДНК, в центре каждой копии содержится STR. Так как количество повторов STR внутри ПЦР продукта может быть разным у разных линий кур и внутри одной особи, то при электрофорезе продуктов ПЦР мы можем получить 1 (гомозигота) или 2 полоски (гетерозигота) в т.ч. разные по размерам у разных особей (разные аллельные варианты) (рисунок 2).
Рисунок 2 - Схема анализа методом электрофореза генетическоих отличий двух особей с разным количеством тандемных повторов ДНК в двух разных участках генома
В приведенном примере, мы можем увидеть результаты анализа микросателлитной ДНК по одному локусу LEI 0234 ремонтного молодняка кур одной из птицефабрик (рисунок 3). STR LEI 0234 (хромосома 2 кур) 216-364 п.н. фланкирована праймерами 5`TGCACGCACTTACATACTTAGAGA 3`, 5`TGTCCTTCCAATTACATTCATGGG-3` с ними мы поствили ПЦР. На электрофорезе мы можем видеть что одни особи имеют одну полоску (гомозиготны по одному из аллельных вариантов), другие гетерозиготны, аллельных вариантов в изучаемом стаде три.
В сложившейся ситуации такая картина вызвает большие сомнения в генетической однородности стада. Обычно четырехлинейные кроссы должны содержать генетически однородные линии прародителей и родителей. Родительские линии АB и CD тоже генетически однородны.
Являясь гибридами прародителей (которые были подвергнуты имбридингу и соответственно уровень гомозиготности у них должен быть очень высоким), ремонтный молодняк родительского стада должен был бы быть или только гетерозиготным, по анализируемому STR, или только гетерозиготным и уж безусловно не иметь целых три разных аллельных варианта данного STR.
Почему это важно?
А потому что, сразу возникает целый ряд вопросов:
1. Если мы наблюдаем целых 6 генотипов среди 24 самок реммолодняка, то из каких источников было собрана партия этих цыплят? Допустим даже это разные микролинии прародителей внутри одной линии которые и должны были бы иметь потомство различающееся по анализируемому локусу. Но тогда сборная партия из шести разных птицефабрик и, скорее всего, регионов несет огромные инфекционные риски.
2. Если речь идет о непонятно каком происхождении данной партии реммолодняка (племенной брак, промышленный кросс проданный под видом родительских форм), то и инфекционные риски возрастают еще в большей степени и продуктивность финального гибрида будет под очень большим вопросом.
3. А о каком тогда эффекте гетерозиса может идти речь, как на уровне родительского стада (яичная продуктивность, качество яйца, иммунитет потомства, иммунитет самого род стада и повышенная вероятность вертикальной передачи инфекционного агента финальному гибриду), так и на уровне финального гибрида?
Конечно же такие анализы делают с целым рядом STR расположенных на разных хромосомах, для большей чувствительности и точности оценки генетического разнообразия в стадах, хотя для первичного скрининга допустимо ограничиться и несколькими локусами, так как в птицеводстве редко стоит задача точной идентификации родителей у отдельных особей (как это имеет место при плем. продажах КРС). То есть, такие исследования в итоге дешевле.
Например, анализ двух партий птицы на одной и той же птицефабрике с использованием праймеров MCW0111 96-120 п.н. 5`GCTCCATGTGAAGTGGTTTA3` 5`-ATGTCCACTTGTCAATGATG-3`; MCW0016 162-206 п.н. 5`-ATGGCGCAGAAGGCAAAGCGATAT- 3` 5`-TGGCTTCTGAAGCAGTTGCTATGG- 3`; LEI0166 354-370 п.н. 5`CTCCTGCCCTTAGCTACGCA3`, 5`TATCCCCTGGCTGGGAGTTT 3` Показал довольно разные результаты генетической однородности.
На одном из родительских стад мы не увидели никаких генетических различий (таблица 1), на втором – генетическая однородность варьировала от 100% до 80% т.е. в данном конкретном случае нибольее информативным был анализ STR LEI0234.
Таблица 1 - Результаты анализа разнообразия микросателлитных аллелей
На самом деле, сама технология селекционного процесса не гарантирует получение полностью гомозиготных прародительских форм. Поэтому аргументы представителей компании поставщика звучат в стиле – а это так и должно быть в норме для нашей птицы!
Схема контроля должна формироваться по следующему алгоритму:
1. Совместно с представителем компании поставщика племенной птицы комиссионно отобрать по 200 проб крови отдельно от курочек и петушков, разделить каждую пробу на 2-3 пробирки и все это заморозить.
2. Если появится партия родителей отколняющаяся по показателям продуктивности, неоднородная по фенотипу или продуктивности, заболеваемости, то можно вызвать представителя фирмы-поставщика и повторить процедуру комиссионного взятия биоматериала (по 200 проб)
3. Пробирки и инструментарий для забора крови желательно должен быть одноразовым.
4. Далее можно будет сравнить генетические характеристики птицы от РАЗНЫХ партий или с РАЗНЫМИ характеристиками фенотипа, продуктивности, клиническим статусом в т.ч. сопоставить результаты полученные в разных лабораториях (если у компании поставщика возникнуть сомнения в точности и достоверности результатов).
Как правило, потребности в таких исследованиях в итоге не возникает и все затраты сводятся к приобретению пакета с пробирками и скарификаторов/инъекционных игл. Сама возможность проверки дисциплинирует поставщика плем птицы.
Теперь давайте разберем причины, почему исходные родительские линии должны быть гомозиготны по максимально большому количеству локусов ДНК?
Если осуществлять выбраковку птицы по хозяйственно-полезным признакам в условиях имбридинга, то появляется возможность элиминировать больше аллельных вариантов генов снижающих выживаемость, показатели продуктивности, конверсии корма и т.д.
В том числе получится выбраковать птицу с рецессивными (скрытыми) признаками. По законам диалектики – чтобы получить хороший результат от гибридизации, нужно сначала добиться приемлемых показателей в условиях имбридинга у прародительских линий. Так как необходимые производственные показатели птицы могут быть достигнуты за счет разных молекулярных и клеточных механизмов, то при гибридизации мы можем достичь суммации эффектов от этих механизмов и получить эффект гетерозиса т.е. существенное повышение экономической эффективности финального гибрида. Поэтому на родительских формах и финальных кроссах высокий уровень гетерозиготности становится положительным показателем.
Влияние генетического разнообразия на специфический иммунитет
Один из важнейших эффектов гетерозиса - иммунитет. Способность организма реагировать на максимально широкий спектр патогенов тесно связана с «репертуаром» T-клеточных рецепторов и антигенсвязывающих цепей антител у Т и B лимфоцитов, соответственно.
Также сюда добавляется разнообразие молекул обусловливающих связывание антигенов и их транспорт на поверхности макрофагов (рисунок 4). Если гены кодирующие все перечисленные функции находятся в гетерозиготном состоянии, то количество распознаваемых антигенов в одних случаях увеличивается в разы, а в таких случаях как формирование репертуара иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов, то речь идет о повышении этих параметров на порядки... Ведь после вылупления цыпленка происходит рекомбинация генов кодирующих тежелые и легкие цепи иммунолобулинов и Ig-подобные домены Т-клеточных рецепторов, связанных соответственно с гуморральным и клеточным иммунитетом.
Рисунок 4 - Схема транспорта и отбора и экспонирования на клеточной поверхности фрагментов антигенов (вирусов, бактерий) с участием белков Tap-1 и Tap2, MHC-1 (Natarajan K, Jiang J, Margulies DH. 2019).
По данным International Chicken Polymorphisms Map Consortium количество SNP (однонуклеотидных полиморфизмов) в генах TAP1 и 2 превышает среднее количество таких мутаций для 16 хромосомы. MHC-I,
Гены BF и гены TAP показали высокое разнообразие, что согласуется с их антигенпрезентирующей ролью. Гены BF кодируют типичные гликопротеины MHC класса I. Экзон 2 и экзон 3 генов BF, кодирующих домены α1 и α2 MHC-I, связаны с устойчивостью ко многим заболеваниям птиц (Hunt and Fulton, 1998; Kaufman et al., 1999; Rogers et al., 2003). Молекулы TAP являются частью пути процессинга антигенов MHC класса I (Pamer and Cresswell, 1998). Гетеродимер ТАР, образованный ТАР1 и ТАР2, транспортирует антигенные пептиды в эндоплазматический ретикулум ( Spies et al., 2008). Как только пептид в просвете ЭПР связывается с молекулами класса I, комплекс МНС класса I, β2m и пептида то он перемещается на поверхность клетки, и пептид будет представлен CD8+ Т-клеткам (Pamer and Cresswell, 1998). Являясь ключевыми компонентами пути представления антигена MHC-I, сверхвысокий полиморфизм гена BF и гена TAP потенциально способствует высокоэффективной презентации антигена и устойчивости хозяина широкого спектра к патогенам. Таким образом, высокий уровень гетерозиготность данного участка 16 хромосомы, потенциально должен обеспечивать широкий спектром устойчивости к болезням, без существенного повышения затрат корма на обеспечение повышенной иммунореактивности организма.
Микросателлитный локус LEI0258, расположен в этой области BF/BL (хромосома 16), используется для анализа генетического разнообразия, кур (Huang et al. 2016). Соответственно, можно рекомендовать анализ именно этого микросателлитного локуса для оценки гетерозиготности родительских форм и финальных гибридов как при селекции яичных и мясных кроссов, так и для контроля качества комплектуемого поголовья.
Для более углубленной селекционной работы и для анализа вклада в сохранность птицы различных генотипов, в условиях крупных птицефабрик, перспективным представляется HRM анализ высокополиморфных участков генов MHC I и TAP потому что уже на многих птицефабриках есть необходимое для этого оборудование а стоимость реагентов для такого анализа не превышает и даже ниже чем используемые этими же птицефабриками тест-системы для ПЦР.
Какие проблемы могут быть связаны с повышенным иммунитетом-иммунореактивностью?
Гибель птицы от Ньюкаслской болезни, гриппа, аденовирусной инфекции в первую очередь связана с реакцией иммунной системы повреждающей клетки и ткани. Отеки и тромбозы опосредованные реакцией иммунной системы повреждают сосуды, вызывают дыхательную недостаточность и повышенный отход. Перенесенные миокардиты вирусного генеза (аденовирусы, метапневмовирус, коронавирусы) завершаются миокардиосклерозом и пожизненными респираторными проблемами. А степень повреждения миокарда тоже зависит от иммунореактивности организма.
Продуктивность птицы тоже может радикально снижаться в условиях активизации иммунной системы, особенно при воздействии кишечных вирусов, гнилостной микрофлоры, одноклеточных паразитов. Таким образом, селекция птицы в направлении повышения иммунитета т.е. иммунореактивности увеличивает затраты корма на работу защитных систем организма. Да, показана связь между некоторыми аллельными вариантами ФНО альфа, ИЛ2, Ил18 и инфицированностью птицы сальмонеллами.
Вот только и продуктивность такой птицы ниже. Получается – при селекции на продуктивность, конверсию корма происходит коссвенный отбор на пониженную иммунореактивность. В первом приближении это даже прекрасно – снижается и смертность от респираторных патологий. Однако может вырасти инфицированность. Более того, рассмотрим модель естественного отбора в стаде кур инфицированных сальмонеллами. Заражение сальмонеллой серотипа Enteritidis чревато повышенной смертностью птицы от овариосальпингитов и желточных перитонитов, снижением яичной продуктивности и повышенной гибелью молодняка в первые дни жизни.
Появление птицы устойчивой к этим патологиям при заражении сальмонеллами, создает эволюционную выгоду – увеличивается количество жизнеспособного потомства, снижается риск преждевременной смерти и т.д. сохранение бессимптомного носительства (что весьма часто при формировании конституциональной устойчивости к заболеванию) эту эволюционную выгоду увеличивает. Заражение птицы с исходным генотипом, заражение потомства этой птицы от потомства курицы с новым генотипом, способствует дальнейшему увеличению удельной доли генов такой курицы и, следовательно, закрепляется естественным отбором (рисунок 5).
Рисунок 5- Схема естественного отбора на повышение восприимчивости к бактерионосительству, как элемента внутривидовой конкуренции.
Поэтому отсутствие контрселекции в отношении повышения восприимчивости к заражению вертикально передающимися возбудителями инфекций (сальмонеллы, микоплазмы и т.д.) несет огромнное влияние на эпидемическое и эпизоотическое благополучия целых континентов. Адекватно оценить и выявить генетические маркеры требующиеся для такой контрселекции (маркерной селекции) мы можем только на крупных птицефабриках, где выращивается финальный гибрид, в условиях традиционной плотности посадки, стандартных технологий выращивания, кормления и т.д.
Современные возможности высокопроизводительного секвенирования позволяют относительно дешево сравнить генетические характеристики, например, больной и здоровой птицы в условиях вспышки гриппа, или инфицированной и не инфицированной сальмонеллами (если собрать пробы крови от сотен птиц с соответствующим клиническим статусом, пулировать и проанализировать как генотипическое, так и гаплотипическое разнообразие). Такие работы возможны только при условии тесного сотрудничества между селекционерами и крупными птицевабриками.
На круглом столе по вопросам ветеринарной генетики кур «Ветеринария АПК 2022. Новосибирск» ветеринарные специалисты в дискуссии с селекционерами пришли к следующим выводам:
1. Нецелесообразна селекция на повышенную иммунореактивность ввиду существенного экономического ущерба и невозможности вести селекцию в отношении устойчивости к широкому кругу заболеваний
2. Однако, представляется возможным добиваться максимальной гетерозиготности и искать оптимальные аллельные варианты генов связанных со специфическим иммунитетом, обеспечивающих расширение спектра антигенов в отношении которых может формироваться специфический иммунный ответ
3. Очевидно существуют проблемы с развитием сердечно-сосудистой системы, что провоцирует рост смертности сразу от широкого спектра вирусных и бактериальных инфекций
4. В отношении наиболее актуальных инфекций, в первую очередь вертикально-передающихся необходимость контрселекции также очевидна.
Авторы:
Василий Афонюшкин (Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН, Новосибирск), Кандидат биологических наук, ветеринарный врач. Область научных интересов – поиск новых инфекций птицы и человека, изучение патогенеза заболеваний птицы. Автор более 190 статей, 18 патентов. Научные дисциплины – молекулярная биология, патологическая гистология, микробиология, иммунология.
Арина Ширшова (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск), м.н.с., директор ООО «Биоветпрактика».
