В лекция о лечении антибактериальных болезней рыб д-р Том Виклунд, заведующий лабораторией водной патобиологии, доцент кафедры патологии рыб Академии Або, Финляндия. расскажет о бактериофагах — альтернативной стратегии использованию антибиотиков.
Содержание
Описание фагов и их взаимодействия с бактериями
Как и бактерии, фаги присутствуют везде в окружающей среде, а также в животных. Они считаются наиболее распространенной биологической формой. Вирусы, как и фаги не имеют собственного метаболизма, их-за этого не считаются организмами. Они всегда зависят от хозяина. Они заражают хозяина, и после, хозяин, воспроизводит новые вирусы, новые фаги.
Большая часть вирусов представлена в водной среде и большая часть этих вирусов в водной среде — это бактериофаги. В среднем, мы можем сказать, что у нас 5×107 фагов/мл в морской воде. Это 50 миллионов фагов на мл воды. Всего около 4×1030, это единица с тридцатью нулями, в морской среде. В человеке, в нашем кишечнике, находится около 1010 до 1012 фагов /г человеческих экскрементов. Это также очень много, и значит, что фаги очень важны и для окружающей среды, и для человека, и для животных. Считается, что почти половина бактерий в морях, в окружающей среде, в водной среде лизируются каждый день благодаря фагам.
Что такое фаг? Это вирус, инфицирующий только бактерии и также археи. Некоторые фаги могут поражать и бактерии, и археи, некоторые только археи или только бактерии. Эти фаги, эти вирусы не инфицируют эукариот или высшие организмы. Состоят из головки, воротничка, хвостового отростка и хвостовых ворсинок. Размер хвостового отростка может варьироваться очень сильно, и также есть фаги без хвоста. Головка состоит из белковой капсулы, содержащей геном (геном может быть либо ДНК, или РНК). У фагов есть определенный цикл, хотя на самом деле два разных цикла. Бактерия может быть лизирована (растворена) или убита фагом, или же геном фага может внедряться в геном бактерии.
Здесь слева мы видим литический цикл, где фаг инфицирует бактерию, и бактерия производит новые фаги, которые потом лизируют (растворяют) бактерию, она умирает, а фаги уходят. Лизогенный цикл, в этом цикле, геном фага внедряется в геном бактерии, бактерия продолжает жить и делиться и т. д., а геном фага перемещается дальше внутри этой популяции бактерий. Затем в определённый момент (условия), гены фага активизируются, и бактерия начинает производить новые фаги, и бактерия или фаг переходят в литический цикл.
Для того чтобы инфицировать бактерию, фагу нужно прикрепиться к рецептору. Есть множество разных рецепторов на бактериальной клетке — поверхность на которой могут закрепиться фаги. На изображении справа представлены разные типы рецепторов. Это могут быть гликолипиды, порин ompF, белки жгутиков и т. д.
Конкретные фаги обладают узким или крайне широким спектром инфицирования. Один фаг заражает конкретный штамм бактериального вида. Или он может инфицировать несколько штаммов одного вида, или инфицировать тесно взаимосвязанные бактериальные виды. Также фаг может инфицировать неродственные виды бактерий (тогда он обладает широким спектром инфицирования).
Конечно, у бактерии есть системы защиты против фагов, например система CRISPR-Cas. Но есть и другие системы, позволяющие избегать инфицирования фагами. Бактерия очень быстро вырабатывает резистентность к фагам. Но, когда они развивают резистентность к фагам, иногда они становятся невирулентными. Они невирулентны более для хозяина. Фаги использовались длительное время в определенных странах. Фаги, использующиеся сейчас, для разных областей применения, обычно берутся из окружающей среды и обогащаются в лабораторных условиях, так что можно получить большой объем фагов. Применяются фаги, полученные биотехнологическими методами. Но прежде, чем использовать фаг, взятый из окружающей среды, фаги должны быть исследованы на активность в отношении патогенов, прежде чем использоваться в терапии. Вы должны быть уверены, что они на самом деле активны в отношении патогенов, в отношении того, против чего они будут использованы. Как правило, применяется «коктейль» из трех до пяти, шести разных фагов. Для того, чтобы избежать развития фагорезистентной бактерии.
Сегодня фаги используются, в некоторых странах, для лечения хронических болезней у людей. В данный момент это не допускается, мне кажется в ЕС, но используется в таких странах как Грузия, Россия, возможно Польша. И чаще всего для инфекций ран. Например, на ногах, как можно увидеть на изображении ниже.
Особенно используются для лечения резистентных к антибиотикам бактерий. Если у нас есть резистентные к антибиотику бактерии на ранах, то отсутствует возможность использования антибиотиков, потому что мы не знаем какой именно можно использовать. А фаги могут быть очень эффективны в уничтожении бактерии, вызывающих данные язвы (см. ихображение).
Фаги также используются для лечения бактериальных болезней растений, как например картофельная чума в Великобритании. И недавно применение фагов было одобрено в Евросоюзе для контроля листериоза и сальмонеллеза в мясных продуктах, сыре и овощах. Фаги распылялись на мясные продукты и овощи. Фаги используются для лечения мастита крупного рогатого скота, вызываемого резистентным золотым стафилококком или кишечной полочкой. Применяются для обеззараживания поверхностей от патогенов листерий и кишечной палочки на хозяйствах и предприятиях.
Использование фагов в обществе и в аквакультуре
Недавно фаги были одобрены властями США к применению у пациентов с Covid-19, пострадавших от опасных вторичных инфекций, например от Acinetobacter baumannii (Акинетобактерия Баумана). Акинетобактерия Баумана часто мультирезистентна к нескольким разным антибиотикам.
Фаги также испытывали, в попытке контролировать, в борьбе с различными бактериальными патогенами рыб. В основном, в лабораторных условиях. Например, в борьбе с Lactococcus garvieae в желтохвосте, Pseudomonas plecoglossisida в рыбе аю, Flavobacterium columnare в радужной форели, Flavobacterium psychrophilum в радужной форели, Vibrio anguillarum в Атлантическом лососе, Аeromonas hydrophila в соме, Edwardsiella ictaluri тоже в соме, Aeromonas salmonicida в радужной форели и в речной форели и Vibrio harveyi креветок, в условиях рыбного хозяйства. В борьбе с Vibrio harveyi фаги сегодня используются в условиях рыбного хозяйства, но только для креветок.
Фаги в аквакультуре могут использоваться для дезинфекции воды, при попытке избавиться от бактерий в воде или на поверхностях. Для снижения численности вредных бактерий на поверхности резервуаров, где бактерии формируют биопленки, или в воде. Могут быть использованы для дезинфекции икры и лечения больной рыбы, малой рыбы, в особенности мальков. И профилактическое применение в борьбе с бактериальными патогенами.
Взаимодействие между фагами и Flavobacterium psychrophilum
Перейдём к экспериментам, которые мы провели, в борьбе с Flavobacterium psychrophilum. Ранее я говорил о Flavobacterium psychrophilum, которая вызывает серьезные проблемы при выращивании радужной форели по всему миру. Нет общедоступной коммерческой вакцины. Антибиотики применяются неоднократно. Хозяйство использует по крайней мере один антибиотик для лечения, но чаще всего два или даже три, в течение сезона.
Использование фагов против этого патогена интенсивно изучалось недавно в нашей лаборатории в рамках проекта BONUS FLAVOPHAGE. Мы тестировали некоторое количество фагов, изолированных фагов, из окружающей среды, из зараженной рыбы и также из воды рыбного хозяйства. Тестировали чувствительность разных изолятов Flavobacterium psychrophilum. На изображении внизу горизонтальные линии, где слева у нас присутствуют бактерии, а фаги наверху.
Мы перемешали фагов со штаммами бактерий и проверили, были ли штаммы бактерий чувствительны или резистентные к фагам. У нас было около 20-30 штаммов бактерий, и около 100, возможно, 200 разных фагов. И как Вы видите из этой схемы, у нас есть разные клетки. Одна клетка представляет одно взаимодействие штамма бактерии и фага. Клетки могут быть черными (означает, что фаги воздействуют на бактерию и лизируют (растворяют) ее. Клетки могут быть серыми (фаги подавляют рост бактерий, не вызывая лизис бактериальных клеток). Белый цвет — фаги не оказывают воздействия на бактерии. Здесь Вы также можете увидеть места, которые почти полностью белые или белый цвет доминирует. Это значит, что фаги не воздействуют на все исследуемые бактерии. Затем у нас область или группу фагов, которые очень эффективны. Они лизируют (растворяют) большинство бактерий. И в противоположность, мы видим, что некоторые изоляты бактерий (в середине, выделенные желтым) не подвергаются воздействию фагов. Внизу представлены два изолята бактерий, на которые не подействовал ни один из фагов. Это дает картину, сколько вариаций мы имеем. У нас есть определенное количество фагов, некоторые из них влияют на многих бактериальных изолятов одного вида, а другие не влияют. Здесь есть, что проверять, это нужно проверять, а после создавать «коктейль», который можно применять для лечения бактериальных инфекций.
Ранее я рассказывал вам о бактериальных биопленках и Flavobacterium psychrophilum создающей биопленки в рыбных хозяйствах, в резервуарах. Бактерии используют корм для рыб и рыбную слизь как источник питания. Они получают питание и строят огромные биопленки. Можно ли подавить образование пленок или их рот при помощи фагов? Мы также проводили тесты, и здесь Вы можете увидеть на схеме справа результат, который мы получили.
Два бактериальных изолята, которые чувствительны к бактериофагам. Внизу изолят, который резистентен к бактериофагам. Затем мы исследовали три этапа формирования биопленки: этап первый — исходное закрепление, второй — колонизация биопленки и третий — созревшая биопленка. Вы видите различные столбцы, и чем меньше столбец — тем более эффективны фаги. И в диаграмме наверху, можно увидеть, что «коктейль» из фагов сокращает все три стадия развития биопленки: прикрепления, колонизации и биопленки. На второй бактерии у нас такой же сценарий. А внизу, где бактерия резистентна к фагам и у нее хорошая выживаемость. После воздействия мы измерили некоторое количество биопленок и сравнили концентрацию с количеством биопленок. На всех изученных этапах жизненного цикла биопленки было явно отмечено сокращение ее объема.
Могут ли фаги влиять на вспышки заболевания среди рыб? Мы провели лабораторный эксперимент, где рыбы были инфицированы бактерий в различных дозировках. Мы дали разные дозировки бактерий рыбам и спустя пару дней, инъекционно ввели бактериофаги. Короткое заключение — наблюдался явный защитный эффект.
На диаграмме слева мы видим вероятность выживания рыбы и на оси Х — дни после испытания. Выше — рыба, которой вводили фаги, и там почти нет смертности, умерла только одна рыба. В PHR (соотношение фаг — хозяин) с самой высокой дозировкой, более чем 75% рыбы выжило, где была высокая концентрация фагов по отношению к бактериям. Если мы уменьшим этот рацион, количество вводимых фагов станет меньше по отношению к бактериям, то уменьшается и показатель выживаемости до 50%. И если рыба была инфицирована только бактерией — показатель выживаемости 40%. Заключение всего этого, если мы внедрим фага в рыбу, где присутствует инфекция Flavobacterium psychrophilum, то фаги могут бороться с этой инфекцией и рыба выживет. Это не может быть сделано в рыбном хозяйстве, так как мы вводим инъекцию непосредственно в каждую рыбу, поэтому фаги должны поступать другим способом. Фаги добавляются прямо в воду и поступают в организм через кожные покровы и жабры. Или фаги добавляются через корм.
И на изображении мы видим, что фаги прикрепились к корму. На верхней половине картинки мы видим еду без фагов, а на нижней — еду, содержащую фаги. Так же здесь есть бактерия. И если фаги и бактерия находятся вместе, то фаги лизируют (растворяют) бактерию и появляется «чистая зона». На верхней части «чистых зон» нет, так как отсутствуют фаги. Это вариант, давать фаги рыбам вместе с кормом.
Также проводились исследования сочетания антибиотиков с фагами против определённых бактериальных инфекций. Эти исследования проводились in vitro (в лабораториях) и также проводились in vivo (исследования на человеке, мышах, бройлерах и беспозвоночных). Преимущество — усиленное подавление бактерий.
У нас присутствуют и антибиотик, и бактериофаг, где антибиотик подавляет размножение бактерии, а фаги убивают бактерию. Эта система может быть более эффективна против биопленок, так как есть эффективное проникновение внутрь биопленки. У нас есть фаги, убивающие бактерий на поверхности, а после антибиотик, проникающий внутрь и убивающих остальных бактерий. В этой системе более низкие шансы выработки резистентности к фагам. Были выявлены как положительные, так и отрицательные взаимодействия между антибиотиками и фагами. Положительный итог в том, что фаги и антибиотики работают очень хорошо, а отрицательный итог — что все-таки есть некие помехи между фагами и антибиотиками. Необходимо проведение дополнительных исследований, конечно, но, возможно это и есть путь решения проблемы развития резистентности в бактериях.
Каковы испытания лечения фагами? Нужно, конечно, обновление законодательных основ, потому что на данный момент есть запрет на использование, например, в ЕС. Оптимизация производственных процессов, как фаги должны производится в крупных масштабах. Для подготовки «коктейлей» необходимо содержать коллекцию литических фагов. Это нужно для коллекции, где мы знаем, какой тип бактерии умерщвляется определенным фагом. Коллекции должны постоянно обновляться за счет включения новых фагов. Новые фаги должны изолироваться из окружающей среды. Следует использовать «коктейли», способные распознавать различные рецепторы, мы должны знать рецепторы определённого фага. Бактерии достаточно быстро вырабатывают резистентность к фагам, поэтому необходимо применять те фаги, которые активны по отношению к резистентным к фагам бактериям.
Все используемые фаги необходимо проверять на предмет наличия генов токсинов или генов резистентности к антибиотикам. Проблемой может стать выработка эндокосинов, потому что, когда фаги инфицируют бактерию — бактерия лизируется (растворяется). А когда лизируется большое количество бактерий, ЛПС (липополисахариды) освобождаются прямо в организм рыбы или животного и ЛС будет отрицательно влиять на хозяина. Также неизвестно, есть ли фаги в рыбе или выработка антител к фагам. Это должно исследоваться. Проблема фагов в том, что они не могут быть использованы по отношению к внутриклеточным бактериям, таких как бактерии почечной болезни или Piscirickettssia.
В заключении, фаги имеют высокую степень специфичности, поскольку нацелены на конкретный бактериальный патоген. И когда хозяин бактерии исчезает, то тоже происходит и с фагом. Они не остаются жизнеспособными в окружающей среде или в хозяине. Фаги безвредны для других организмов в отличие от бактерий, они не влияют на эукариот. Фаги представляют собой реальную альтернативу применению антибиотиков в аквакультуре. Фаги могут использоваться для снижения риска инфицирования бактериальными патогенами. Фаги должны быть подробно охарактеризованы и исследованы перед применением.
Д-р Том Виклунд, заведующий лабораторией водной патобиологии, доцент кафедры патологии рыб Академии Або, Финляндия. Лекция проведена в рамках курса «Бактериальные болезни лососевых рыб».
