Бактериальные болезни рыб наносят большой ущерб аквакультурным хозяйствам. В лекции доктора Тома Виклунда разбирается понятие «бактерия», чем она является и как характеризуется. Эксперт представляет информацию о жизни бактерий, размножении, росте, условиях обитания, о том, как они взаимодействуют друг с другом и как производят биопленку. Кроме того, Том Виклунд поясняет, какую роль играет бактерия, ее роль в окружающей среде для человечества и рыбы, а также как изолировать бактерию от рыбы и где и как найти этот крошечный организм в ней.
Содержание
Определение бактерии
Сама по себе бактерия состоит из определенных доменов (сфер). Существуют 3 разных домена, к которым принадлежат все организмы: бактерии, археи и эукариоты. Бактерия включает в себя все бактериальные особи, археи представляют собой одноклеточные организмы, внешне схожие с бактериями и очень маленькие по размеру, а все остальные виды организмов являются частью домена эукариоты. Бактерии и археи отличаются от эукариот. Вместе они (бактерии и археи) образуют группу прокариоты. «Pro» значит — «до», а «эукариот» значит «ядро». Исходя из этого становится понятно, что бактерии и археи не имеют ядра, а организмы из группы эукариоты, наоборот, имеют. Какие же другие различия существуют между бактериями (прокариотами) и эукариотами, за исключением наличия ядра?
Все бактерии являются мембранносвязанными органеллами. Обычно у них есть одна хромосома и сверхмалый, округлой формы, генетический материал, который называется «плазмида».
Особенность плазмид заключается в том, что они могут быть перенесены из одной клетки в другую. Также можно упомянуть такого прокариота как митохондрия. Митохондрия является органеллой, производящая энергию, которую бактерия использует для роста и размножения. Сам механизм выработки энергии отличается от эукариот.
Бактерии подразделяются на две большие группы: грамположительные и грамотрицательные клетки.
На иллюстрации представлена грамотрицательная клеточная мембрана (или клеточная оболочка). Это увеличенное изображение бактерии. Здесь можно увидеть 2 оболочки: внешнюю и внутреннюю. Посередине представлен коричневый пласт (слой), называющийся «пептидогликан». На внешней оболочке можно увидеть углеводы, «торчащие» прямо из наружного липосахаридного слоя.
Также здесь представлены грамположительные клетки, на иллюстрации выглядящие как клетки с плотным коричневым слоем. При использовании метода окрашивания Грама, грамоположительные бактерии становятся голубыми, а грамотрицательные клетки не меняют цвет при использовании окраски по методу Грама. Все это видно при рассмотрении клеток через микроскоп.
Бактерии, фактически окружают нас. Но их не возможно увидеть невооруженным глазом, настолько они малы. Бактерии встречаются в виде одиночных клеток или цепочках (кластерах). Размеры бактерий варьируются от 0,5 до 10 мКм (микрометров). Если перевести в миллиметры, то это 0,005 — 0,1 мм.
По внешнему виду имеются незначительные различия; палочки, коки (изображения которых мы видим на слайде сверху справа), спириллы, фибриллы и плеаморфы — у них отсутствует характерная форма.
Внизу слева мы можем увидеть грамположительные палочки, а справа, тоже бактерии — палочки, но грамотрицательные. На этой иллюстрации чётко видно различие по цвету, между грамположительной и грамотрицательной клеткой.
Бактерии находятся вокруг нас: на различных поверхностях, на наших руках, внутри нашего организма, в кишечнике, везде — бактерии. На картинке сверху справа мы видим клетку — эукариот, с бактерией внутри. Большинство бактерий безвредны для других организмов. Это значит, что они не оказывают негативного влияния на организм.
Жизнь сейчас совершенно невозможна без бактерий. Существует лишь небольшое количество бактерий, вызывающих болезни. Они оказывают вредное воздействие на нас, на фермерских и домашних животных. Эти бактерии вызывают болезнь и организм должен с ними бороться. В целом, мы можем сказать, что одна бактерия (патоген) равна одной болезни. Другая бактерия равна другой болезни.
Как уже упоминалось, бактерии везде. Так как же обозначить численность бактерий на нашей планете? Вычисления показывают, что количество бактерий на земле равняется 1030. Это очень много. Если мы сравним с количеством частиц в пустыне Сахара, то это 2×1024, а с количеством звёзд во вселенной, то это 7×1022. Мы видим, что частиц песка в Сахаре гораздо меньше, чем бактерий. Количество бактерий в каждом из нас, снаружи и внутри, равняется 3,8×1013. Количество людей 7×1010, ~ 7 млрд.
Самая распространённая бактерия, наиболее известная как Pelagibacter ubique 2×1028. Её можно обнаружить в Саргассовом море и она очень мала, около 0,1 мКм в длину. 30% её объёма занимает ДНК. Так как эта бактерия очень распространена, то она обладает существенным значением в окружающей среде. Это очень важно.
Предположим, что если она исчезнет, то и всё изменится вокруг. И если мы возьмём все бактерии в мире и положим на одну чашу весов, то масса бактерий будет соответствовать массе 50-ти миллионам синих китов. Биомасса этой бактерии огромна. Большая часть бактерий находится в водной среде. Примечательно, что половина этих бактерий подвергается воздействию вирусов.
Характеристики бактерии
Размножение
Теперь поговорим о размножении. Мы знаем, как это происходит у животных. Есть мужская и женская особи, они спариваются, формируется эмбрион, а из него уже новый индивидуум. Но, когда мы говорим о бактерии, то стоит отметить, что в этом случае половое размножение как таковое отсутствует. Вместо этого, бактерии размножаются бинарным способом.
Это значит, что одна бактерия делится на две идентичные. Всё это зависит от оптимальных питательных и экологических условий, при которых клетки делятся каждые 20-60 минут на 2 одинаковые. Из одной клетки появляются 16 миллионов клеток через 24 часа при ежечасном делении. Из одной клетки — огромное количество клеток, или из одной популяции — огромнейшая численность всего лишь за 1-2 дня.
Если есть недостаток питательных веществ, который подавляет (тормозит) бактерию, то она не может продуктивно размножаться. Бактерии разделяются на 2 идентичные клетки, но не всё из этого соответствует истине, потому что всегда есть место для мутации.
Ярким примером является вирус Covid, который постоянно мутирует. Тот же самое происходит и с бактерией. При каждом делении могут происходить изменения, зависящие от того, положительная это мутация или отрицательная. То есть продолжит клетка свое деление или погибнет. Бактерии обмениваются свои генетическим материалом.
Плазмиды передают генетический материал из одной клетки в другую. Это обозначает эволюцию. Эволюцию бактериальных клеток, из одной в другие, включающую мутацию и происходящую очень быстро по времени. Эти мутации и изменения в генетическом коде, в ДНК — основа для эволюции бактерии и изменения внутри самой бактерии.
Возьмем, как пример, собак. У нас есть несколько пород, которые выглядят по-разному, ведут себя по разному, но все принадлежат к одному виду — собаки. То же самое с бактерией. У нас есть один вид бактерии, у которой много разных форм и которые могут вести себя по-разному. И это очень важно для выживания вида. Чем больше изменений — тем больше шанс на выживание для этого вида, так как постоянно меняются условия окружающей среды.
Мутации и изменения в геноме приводят к появлению новых видов. Собака с большим количеством лап, теоретически, больше приспособлена с окружающей среде, чем собаки с четырьмя лапами. То есть если она лучше адаптирована, то ее шансы на выживание гораздо больше. Так же происходит и у бактерий. Все вариации детерминированы (определены) генетически, они изначально заложены в ДНК. И эти изменения приводят к появлению новых вариантов. А те, которые не очень приспособлены к среде обитания — быстро исчезнут. Более новые, адаптированные варианты, возникают постоянно. Например: у нас есть популяция с небольшим количеством устойчивых к антибиотикам клеток, скажем в диапазоне от 1 к 1 млн. То есть одна из 1 млн клеток устойчива к антибиотику. Затем мы добавим какой-нибудь антибиотик в эту популяцию. По итогу это будет обозначать, что все клетки будут им поражены, за исключением клеток, резистентных к нему. Спустя время, чувствительные клетки исчезнут или погибнут. Останутся только устойчивые (резистентные) клетки. Этот пример объясняет, как окружающая среда влияет на популяцию бактерий. Хотя этот пример — смоделированная ситуация, но мы должны понимать, что в окружающей среде происходит множества разных ситуаций. Есть много других внешних раздражителей, помимо антибиотиков.
На сегодняшний день описано около 10.000 бактерий, но это не так много. Ученые считают, что существует от 100.000 до 10 млн видов бактерий. Если мы представим, что есть более 30.000 видов рыб на планете Земля, то эти 10.000 действительно маленькая цифра. В будущем, конечно, количество видов будет намного больше.
Говоря об изменениях, мы имеем в виду один вид, как в примере с собаками, так и в примере с бактериями. Здесь у нас представлена бактерия Flavobacterium psychrophilum и ее глобальная структура популяции (численности). Посмотрите на картинку, которая состоит из множества точек: черные, желтые и голубые. Точка представляет собой отдельный генетический тип последовательности, то есть генетическую форму вида. Мы видим определенные группы этих точек, которые заражены (на данной картинке примером будет радужная форель).
Clonal Complex (CC) представлен на схеме слева, посередине и справа. Все точки, соединенные линиями, связаны друг с другом формируют единый комплекс. Так же здесь у нас есть и другие комплексы, влияющие на лосося, а внизу мы видим картинку рыбы айю. Очень важно знать, что такое клональный комплекс, его изменеиях и о генетической структуре бактерии. Допустим, Вы производите вакцину. Затем вакцинируете рыбу, а после внезапно осознаете, что вакцина не работает на всех видах рыб, а только против определенного генетического типа. Тогда Вам нуно изменить вакцину, добавив. Новые антигены. В таком случае вакцина будет защищать рыбу и всех особей этого вида от Flavobacterium psycrophilum.
Рост
Быстрое размножение бактерий, деление за 20-60 минут зависит от многих факторов: энергии, pH, температуры, О2. Вот именно поэтому, в нашей жизни, мы используем холодильник, который позволяет уменьшить рост бактерий, благодаря холодной температуре. Некоторые бактерии спокойно находятся в кислородной среде, а другие нет. Они называются анаэробным и живут в той среде, где нет О2 или его уровень чрезвычайно низок.
pH — тоже важный фактор. Некоторые бактерии предпочитают низкий уровень pH, от 0 до 2-х, а другие высокий pH, доходящий до 20-30. Нормальный показатель pH в нашей окружающей среде 7-8. Конечно, бактерии предпочитают богатую питательными веществами среду, вдали от среды с неблагоприятными условиями. Патогены, в таком случае, предпочтительнее атакуют животных, которые полны энергии.
Всегда есть конкуренция между клетками, видами, чтобы найти для себя оптимальную, богатую питательными веществами среду. Бактерии могут передвигаться к окружающей среде, богатой питательными веществами. Это движение называется «хемотаксис». Бактерии могут двигаться к источнику питания и обладают памятью. Бактерии производят белки (ферменты) для разложения сложных молекул, которые используют в качестве энергии. Ферменты разрушаются на молекулы и бактерия поглощает протеины и использует их для своего размножения.
Также бактерии взаимодействуют друг с другом, могут внезапно двинуться в одном направлении и вторгнуться в другой организм, вызвав болезнь. Это взаимодействие, эта сигнальная система, называется «чувство кворума». Не стоит забывать о конкуренции между клетками. Как и у людей, они собираются вместе и соревнуются с другими. Бактерии производят вещества, которые подавляют соперников (конкурентов). Это и является «чувством кворума».
Подвижность
Существуют два вида подвижности у бактерий. Первая — это скользящая. Она осуществляется на поверхности, в том числе и живой. Это очень медленное передвижение, где расстояние в 1 мКм преодолевается очень долго. Самое передвижение осуществляется разными методами: 1. с использованием полисахаридов, которые двигаются назад, проталкивая бактерию вперед. 2. пили, которые последовательно удлиняются и сокращаются, как при подтягивающемся движении. 3. Использование различных белковых комплексов, например, обхватывающие клетку кольца белков. Эти кольца крутятся (как у гусеничного трактора) и помогают бактерии скользить по твердой поверхности.
На иллюстрации мы можем увидеть пример скольжения Flavobacterium psychrophilum. Она медленно движется по дну пластины, на которой содержатся питательные вещества. Она может двигаться по поверхности (повтор). В нижнем треугольнике так же осуществляет движение, но медленнее. А справа мы видим изменения в протеиновой структуре и подвижность, в данной генетически модифицированной клетке, отсутствует.
Теперь поговорим о втором способе передвижения — с помощью жгутиков, расположенных разным образом. Это может быть один жгутик, жгутики могут располагаться на двух противоположных концах клетки, может быть несколько жгутиков или жгутики могут полностью покрывать поверхность клетки. У бактерии жгутики активно вращаются, в отличие от жгутиков эукариот, которые бьются. Это является основным отличие жгутиков эукариот и прокариот.
Итак, как же бактерия находит оптимальный источник питательных веществ хозяина? Используя систему направленного движения — хемотаксис. Движение происходит по принципу химического градиента: в сторону благоприятных условий и в сторону от неблагоприятных. Как же это происходит и как они находят питательную среду? Они обладают памятью, которая запоминает концентрацию питательных веществ с одной стороны, а с другой запоминают изображение.
Они хранят эту информацию в клетках, чтобы потом использовать для координации движений по отношению к стимулу. Затем движутся вперед в одном направлении и, спустя время, снова фиксируют концентрацию питательных веществ. Затем они сравнивают ее с предыдущей, чтобы понять, стала концентрация выше или ниже. Если ниже — нужно сменить направление, выше — они в правильном направлении. Они обязаны фиксировать изменения концентрации питательных веществ, чтобы постоянно обновлять память. Если они не будут этого делать, то движение будет хаотичным.
На иллюстрации выше продемонстрировано хаотичное перемещение бактерий, которые не могут найти источник. А бактерия на нижней части картинки меняет свое направление, так как понимает, что должна двигаться в сторону источника питательных веществ. И когда она его находит, то остается, так как это оптимальная окружающая среда для нее. Она сможет здесь делиться и расти.
Коммуникация
Все это ясно показывает, что бактерии двигаются и живут, что у них сложная система и они могут найти окружающую среду для жизни. Бактерии могут общаться и это взаимодействие называется, «чувством кворума». Бактерии создают сообщество, производя живую биопленку. В этих биопленках огромное количество бактерий. Они создают определенные молекулы, которые делятся изображениями и информацией с другими бактериями, о том сколько их присутствует.
Когда популяция бактерий слишком высока, то тогда, например, они атакуют своего носителя (хозяина)., так как понимают, что их достаточно для того, чтобы напасть на иммунную систему. «Чувство кворума» используется и среди клеток одного вида, и среди клеток разных видов. Этак коммуникация важна для болезнетворных бактерий, но также и для человека — её можно использовать для подавления вспышки болезни. Множество исследований в наши дни акцентируют внимание на «чувстве кворума» молекул, которые побеждают бактериальное «чувство кворума». Некоторые бактерии способны влиять на эту связь с помощью других молекул. Называется это «гашение кворума». И молекулы используют «гашение кворума» по отношению к болезнетворным бактериям.
Справа можно увидеть изображение красной пластины, с бактерией расположенной посередине. Эта бактерия перемещается по поверхности с помощью жгутиков. Когда бактерий много, они начинают размножаться и делиться. Спустя время они понимают, что для них недостаточно питательных веществ и начинают двигаться от центра к периферии на определённую дистанцию и количество бактерий, при этом, продолжает расти и расти. Они снова останавливаются, начинают делиться и когда концентрация бактерий снова становится высокой — двигаются вперед.
На иллюстрации ясно видны эти дорожки передвижения. Некоторые бактерии остаются на своих местах, некоторые идут дальше, на следующий уровень. И все это координируется «чувством кворума» — когда бактерия создает молекулы, а другие это чувствуют.
Биопленка
Биопленка — это и есть то, как растут бактериальные популяции: в группах, в биоплёнке. В большинстве сред обитания бактерии размножаются, в основном, на поверхности в виде биопленок.
Справа наверху дана картинка зубов человека, где бактерия представлена яркими пятнами на определенных участках зубов. Поэтому мы и чистим зубы по утрам и вечерам, чтобы избавиться от биопленок, прежде чем они превратятся в дырки в зубах. Биопленка — это «сообщество микробов, входящих в органическую полимерную матрицу, которые прикрепляют биопленку к поверхности».
На первом изображении и посередине можно увидеть, как прикрепляется и размножается биопленка, увеличиваясь в размерах. Как бактерия покидает биопленку в поисках новой среды обитания, располагается там и создает новую биопленку. Они присутствуют на камнях в воде, в живых организмах, зубах, объектах рыбоводства и оборудовании. В биопленке присутствует не только один вид бактерий, там может быть их несколько. Помимо бактерий, могут обнаруживаться археи и грибок. Известно, что многие бактериальные патогены рыб производят биоплёнки, например Flavobacteria psychrophilum, я Вам уже о ней рассказывал. Но роль таких биопленок пока точно не установлена. Поэтому мы не понимаем роль этих пленок на рыбных производствах и оборудовании.
Биопленка состоит из разных видов клеток: быстрорастущих, медленнорастущих, а также клетки — персистеры (они не растут, у них нет метаболизма, они ждут определённого момента). Эти клетки могут обмениваться ДНК, передавать сигналы от клетки к клетке, изменять физиологию.
Здесь присутствует огромное генетическое разнообразие. Биопленка имеют различные градиенты: кислородный градиент и градиент питательных веществ, который позволяет различным видам бактерий развиваться в разных условиях. Это очень динамическое общество. Справа мы снова видим Flavobacterium psychrophilum, которая формирует биопленку на пластинке. Фото сделано сверху, и мы видим процесс формирования. Размер большой биопленка справа около 100мКм — 0,1 мм и она включает в себя огромное количество клеток, так как сама клетка Flavobacterium psychrophilum около 5 мКм.
Роль бактерии
Бактерии играют важную роль в окружающей среде — являются первичными производителями (связывают углерод и азот), превращают солнечный свет в энергию и производят О2. Без бактерий, содержание кислорода в воздухе было бы гораздо ниже. Бактерии являются редуцентами (деструкторами) всего органического материала не только в акватической среде, но и в почве. Все это происходит с помощью бактерий и грибков. Они ответственны за биодеградацию (биологический распад с помощью микроорганизмов).
Человечество производит много вредных веществ, которые попадают в окружающую среду и есть два пути избавления от них: 1. утилизация и 2. метаболизм грибков и бактерий. На картинке снизу справа мы видим распад толуола в почве, где он разделяется на воду и СО2 полностью. Вот это и есть главная роль биодеградации. Бактерия играет важную роль в биогеохимических процессах углерода и азота, а также в водной среде обитания — это симбиотические воздействия между бактериями и водорослями. Некоторые водоросли не могут без бактерий, поэтому они сосуществуют вместе, обмениваются элементами друг с другом. Без бактерии водоросли могут погибнуть. Есть разные виды взаимодействий. Мутуализм — когда бактерия и хозяин (носитель) взаимодействуют друг с другом, где у одного есть преимущество над другим, но оно не используется во вред. А есть паразитизм — тоже обладание преимуществом одного над другим, но при этом идет нанесение вреда носителю (хозяину). Бактерии и археи могут выживать в экстремальных природных условиях. В холодной или жаркой окружающей среде, археи и бактерии выдерживают температуру в 100, и даже больше, градусов. Так же они смогут приспособиться к низкой или высокой pH среде.
Только небольшое количество бактерий вызывает болезни, но все организмы подвержены бактериальным заболеваниям. В окружающей среде болезни обычно возникают только на индивидуальном уровне. Но в густонаселенных популяциях (например, сельскохозяйственные животные), но, также и среди людей, которые проживают в тесном контакте друг с другом, бывают резкие вспышки заболеваний. Например, дикие рыбы поражаются бактериальным патогеном и мы, иногда, наблюдаем крупные вспышки заболеваний, вызванных вирусом, но не бактерией.
У меня есть пример одной бактерии, неожиданно обнаруженной в человеке в 80-х. Это Helicobacter pylori, располагающаяся в кишечнике человека. Раньше, язву желудка считали физиологической проблемой (вбрасывание множества кислот, которые ее и провоцировали). Но с тех пор, когда эти двое мужчин (на фото сверху) обнаружили helicobacter pylori, стало ясно, что именно она является возбудителем язвы. Безусловно, не исключая другие факторы, провоцирующие заболевание.
При этом бактерии не только причина заболевания, они так же оказывают положительный эффект на хозяев эукариот, включая человека. Наблюдается мутуализм между носителем (хозяином) и бактерией. Если наша внутренняя бактериальная флора кишечника меняется или бактериальная флора менялась, пока мы росли, то теперь, во многих случаях, ученые знают, что изменения во флоре вызывают нарушения в иммунной системе, аллергические заболевания, диабеты 1-й и 2-й степени, неврологические расстройства, аутизм, болезнь Паркинсона, ожирение. Благодаря экспериментам над мышами, известно что недостаток бактерий или стерильность (когда мышь вырастает в абсолютно стерильных условиях) вызывает аномальное развитие и появление заболевания у носителя (хозяина). У нас должны присутствовать эти бактерии, в нашем кишечнике. На примере человека и рыб, а особенно рыб, последнее время мы начали активно использовать пробиотики — бактерии, оказывающие положительное влияние на желудок и кишечник. Они также используются для снижения воздействия болезнетворных патогенов.
Выделение бактерий из рыбы
На картинках мы видим рыбу с различными симптомами заболевания: язвы на чешуе, точечные отметки на чешуе, глубокие язвы в мышечной системе.
Также видны признаки внутреннего поражения болезнью: кровотечения, припухлость внутренних органов, как на селезенке (фото снизу справа). Так как нам необходимо найти бактерию в пораженной болезнью рыбе, нам понадобится стерильный инструмент, питательная среда для роста (агар). На картинках видно два типа питательной среды: банка (посветлее) содержит меньше питательных веществ, другая банка (потемнее) больше питательных веществ. Используются стерильные петли для проб (посмотрите на картинку посередине), чтобы брать пробу из зараженной рыбы (обычно 1-2мКм). Все инструменты дезинфицируются (ножницы, пинцеты) в 70% растворе этанола. Мы берем пробу с рыбы и помещаем ее среду с питательными веществами. Пробы берутся с чешуи, глаз, внутренних органов, кровотечение итд. Это значит, что, взяв пробу с определённой области, пораженной инфекцией, мы изучим поведение той или иной бактерии в питательной среде.
Затем образцы помещаются под определенную температуру (15-20 градусов) на определенной количество часов (24 часа). Иногда на 5-7 дней или даже 10-15 недель. Что у нас происходит? Бактерии растут на поверхностях пластины и образуют колонии. Каждая колония (ясно видны на картинке слева сверху) выросла из одной бактерии, которая поделилась на миллионы. И теперь мы можем их увидеть. На всех фото изображены различные виды бактерий и то, как они преображаются, формируя колонии (говорит названия всех видов бактерий).
Мы видим настоящую культуру, а это означает что в рыбе, из которой был взят образец, есть инфекция. На картинке сверху справа мы видим несколько различных видов бактерий, и очень сложно угадать, где инфекция или иммунная система рыбы изначально была поражена.
В заключение, нужно еще раз отметить: бактерии присутствуют везде. На руках, на пальцах, в ротовой полости, в кишечнике, на одежде, на компьютере, на телефоне — везде! Большинство их них полностью безвредны. Существует большое разнообразие видов бактерий и вариантов внутри вида. Они все присутствуют в окружающей среде. Если это патогены — то вызывают болезни у рыб. Помимо этого есть много других вариантов поражения болезнью, которую они вызывают, схожую по симптомам.
Жизнь невозможна без бактерий. Нам не нужно их бояться. Большинство из них полезны для нас. Бактерии обладают различными, хорошо развитыми свойствами. Они не просто «парят» в окружающей среде, но живут высокоразвитой жизнью. Бактерии вызывают заболевания у большинства организмов, о которых будет рассказано в следующих лекциях.
Д-р Том Виклунд, заведующий лабораторией водной патобиологии, доцент кафедры патологии рыб Академии Або, Финляндия. Лекция проведена в рамках курса «Бактериальные болезни лососевых рыб»
